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ibidi提供了一個(gè)簡單經(jīng)濟(jì)高效的方案,使用可移除的12孔腔室載玻片進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng),固定和染色。培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞并用formalin溶液固定。細(xì)胞核用DAPI和肌動蛋白骨架用DYE-490鬼筆環(huán)肽染色??梢允褂靡豢购投谷旧ㄟ^免疫細(xì)胞化學(xué)探測其他細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。
德國ibidi 81201載玻片
實(shí)驗(yàn)使用的材料和試劑列于下面。
12孔腔室載玻片,可移除(ibidi,81201)
用于腔室的蓋玻片,可移除,24mm x 60 mm(ibidi,10811)
細(xì)胞:MCF-7(CLS,300273)
細(xì)胞培養(yǎng)基
細(xì)胞培養(yǎng)試劑
聚苯硫醚
formalin溶液中性緩沖液,10%(Sigma,HT5011)
染色試劑
o DAPI(Sigma,D954)
o DYE-490鬼筆環(huán)肽(Dynomics,490-33)
安裝介質(zhì):FluoroshieldTm值(Sigma,F(xiàn)6182)
實(shí)驗(yàn)方案:
步驟1:
必須在預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定細(xì)胞系的正確接種濃度。根據(jù)您的細(xì)胞類型,用2-6x10 4細(xì)胞/ ml在2-3天內(nèi)產(chǎn)生匯合的單層。
1.打開12孔可移除腔室載玻片(ibidi,81201)包裝,在無菌條件下可拆除。
2.像往常一樣用胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)細(xì)胞。細(xì)胞濃度為5×104細(xì)胞/ ml MCF-7。
3. 將250μl細(xì)胞懸浮液加入腔室的每個(gè)孔中。避免搖晃,因?yàn)檫@會導(dǎo)致細(xì)胞分布不均勻。
4. 用配套的蓋子蓋住。在37°C和5%CO2下培養(yǎng)。細(xì)胞至少培養(yǎng)24小時(shí),或直到建立融合的單層
步驟2:
固定是染色程序的第一步。目標(biāo)是將細(xì)胞,細(xì)胞形成物或組織維持在其當(dāng)前狀態(tài),并在較長時(shí)間內(nèi)通過化學(xué)試劑保存。
1.小心地吸出細(xì)胞培養(yǎng)基。
2.用PBS洗兩次。
3.加入250μl的formalin溶液。
4.在室溫下孵育30分鐘。
5.小心吸入formalin溶液。
6.用PBS洗滌三次。
步驟3:
應(yīng)根據(jù)感興趣的細(xì)胞結(jié)構(gòu)選擇染色試劑。在該方案中使用DAPI和DYE-490鬼筆環(huán)肽染色MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞核和肌動蛋白骨架。
1.準(zhǔn)備你的染色溶液:· 聚苯硫醚· DYE-490鬼筆環(huán)肽· DAPI 1µg/ml
2.小心吸出PBS。
3.移取250μl染色溶液到每個(gè)孔中
4.在室溫下避光孵育30分鐘
步驟4:
在染色后清洗你的樣本會使背景信號降到很低
1.小心地吸出染色溶液
2.加入250μl緩沖液
3.小心吸入緩沖液
4.重復(fù)步驟2和步驟3一次
步驟5:
從一個(gè)邊部開始,用手或用鑷子小心地取下硅膠墊圈。該步驟應(yīng)以緩慢,穩(wěn)定的進(jìn)行,以避免損壞細(xì)胞層。
步驟6:
完成染色程序后,必須在用顯微鏡成像之前封固樣品。該步驟還防止樣品脫水。
1.將載玻片側(cè)面在干凈的實(shí)驗(yàn)室濕巾上輕敲,從樣品中去除多余的介質(zhì)。
2.將封固劑涂在樣品上。用24毫米x 60毫米的蓋玻片覆蓋安裝的樣品,小心地將蓋玻片放到安裝介質(zhì)上,以避免夾住任何氣泡。推薦使用諸如FluoroshieldTm值(Sigma-Aldrich),Vectashield®(Vector Laboratories Inc.)或ProLongAntifade®(ThermoFisher Scientific)的硬化封固劑。
3.安裝封固劑固化。
步驟7:顯微觀察
使用12孔可移除載玻片培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞,用DAPI和DYE 490鬼筆環(huán)肽染色細(xì)胞結(jié)構(gòu)。使用硬化封固劑安裝載玻片保存樣品以便長期儲存。
圖1用DYE490鬼筆環(huán)肽(左上)染色MCF-7細(xì)胞的肌動蛋白骨架,并用DAPI(右上)染色細(xì)胞核。下圖顯示了合成圖像,其中細(xì)胞核為藍(lán)色,肌動蛋白骨骼為綠色。(比例尺:100μm)