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你是否經(jīng)常使用相差顯微鏡來觀察你的細(xì)胞?那相差顯微鏡是如何工作的?為什么這種顯微鏡技術(shù)對(duì)科學(xué)家如此重要?相位對(duì)比如何使幾乎透明的細(xì)胞清晰可見?來吧,先睹為快。
什么是相差顯微鏡(Phas Contrast Microscopy)
相差顯微鏡是一種特殊的顯微鏡,特別適用于觀察具有很高透明度的對(duì)象,例如生物切片、油膜和位相光柵等等。光波通過這些物體,往往只改變?nèi)肷涔獠ǖ奈幌喽桓淖內(nèi)肷涔獠ǖ脑龇?,由于人眼及所有能量檢測(cè)器只能辨別光波強(qiáng)度上的差別,也即振幅上的差別,而不能辨別位相的變化,因此用普通顯微鏡是難以觀察到這些物體的。透明度很高的物體,也稱為位相物體。相襯法(也叫位相反襯法)是通過空間濾波器將物體的位相信息轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的振幅信息,從而大大提高透明物體的可分辨性,該方法使科學(xué)家能夠以高水平的細(xì)節(jié)觀察有機(jī)和生物樣品,而不需要進(jìn)行樣品制備、染色或標(biāo)記。所以從這個(gè)意義上說,相襯法是一種光學(xué)信息處理方法,而且是最早的信息處理的成果之一,因此在光學(xué)的發(fā)展-史-上具有重要意義。
相差顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別是:用環(huán)狀光闌代替可變光闌,用帶相板的物鏡代替普通物鏡,并帶有一個(gè)合軸用的望遠(yuǎn)鏡。
用途:相差顯微鏡主要用于觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。
基本原理:
相差顯微鏡利用物體不同結(jié)構(gòu)成分之間的折射率和厚度的差別,把通過物體不同部分的光程差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹ü鈴?qiáng)度)的差別,經(jīng)過帶有環(huán)狀光闌的聚光鏡和帶有相位片的相差物鏡實(shí)現(xiàn)觀測(cè)的顯微鏡。主要用于觀察活細(xì)胞或不染色的組織切片,有時(shí)也可用于觀察缺少反差的染色樣品。
相差顯微鏡把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差,從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度,使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。光線透過標(biāo)本后發(fā)生折射,偏離了原來的光路,同時(shí)被延遲了1/4λ(波長),如果再增加或減少1/4λ,則光程差變?yōu)?/2λ,兩束光合軸后干涉加強(qiáng),振幅增大或減下,提高反差。在構(gòu)造上,相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡4個(gè)特殊之處:
1.環(huán)形光闌(annular diaphragm) 位于光源與聚光器之間,作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐,焦聚到標(biāo)本上。
2.相位板(annular phaseplate)在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板,可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種:
?。?)A+相板:將直射光推遲1/4λ,兩組光波合軸后光波相加,振幅加大,標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變亮,形成亮反差(或稱負(fù)反差)。
?。?)B+相板:將衍射光推遲1/4λ,兩組光線合軸后光波相減,振幅變小,形成暗反差(或稱正反差),結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變暗。
3.合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡 (centring telescope):用于調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌的像與相板共軛面-完-全吻合?! ?/span>
相差顯微鏡有哪些優(yōu)點(diǎn)?
相位對(duì)比顯微鏡的一個(gè)重要優(yōu)勢(shì)是可以自然地研究任何活細(xì)胞,而不需要固定、標(biāo)記或染色。
該技術(shù)產(chǎn)生的所有圖像可以是無標(biāo)簽的。這也為研究人員節(jié)省了時(shí)間,并減少了實(shí)驗(yàn)之間出現(xiàn)錯(cuò)誤或變化的機(jī)會(huì)。
相位對(duì)比法對(duì)透明樣品效果很好,因?yàn)轭~外的干擾使樣品更加明顯。在這種技術(shù)中,整個(gè)物體都被照亮了。
對(duì)于研究活細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)成分,相襯顯微鏡提供了相對(duì)較高的分辨率。細(xì)胞線粒體、有絲分裂的染色體、空泡和其他活細(xì)胞成分都可以用這種方法來研究。
相差顯微鏡的組件也可以添加到幾乎所有類型的光學(xué)顯微鏡中,只要相位物鏡符合顯微鏡的管長參數(shù),聚光器可以與正確尺寸的環(huán)形相位環(huán)聯(lián)姻。這使得它成為一種靈活和廣泛適用的技術(shù)。