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流體剪切力實驗:流體環(huán)境下的HUVEC細胞培養(yǎng),真實還原體內(nèi)環(huán)境
這里我們以HUVEC細胞為例,使用ibidi流體剪切力系統(tǒng)進行一個流體條件下的細胞培養(yǎng)與靜置狀態(tài)下的細胞培養(yǎng)的對比實驗。
一.實驗準備實驗材料及設(shè)備
胎牛血清
灌流管,15cm,1.6mm直徑(ibidi,Germany,10962)
封口夾
在實驗開始前一天,請將所有需要使用的試劑,培養(yǎng)基,通道載玻片,灌流管都在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中放置到第二天,排除由于溫度差產(chǎn)生的微量氣泡。
一.)培養(yǎng)細胞
準備HUVECs細胞系,按照常規(guī)細胞培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)。好使用比較健康的內(nèi)皮細胞,以防在做流體實驗時候細胞不能穩(wěn)定貼壁。我們建議使用內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基+10%FCS培養(yǎng)HUVEC。好使用4代以內(nèi)的HUVEC。已獲得較好的實驗結(jié)果。
按照下面流程鋪細胞:
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2.蓋上注液孔蓋,將通道載玻片放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)半小時,等待細胞貼壁。細胞貼壁后,拿出通道載玻片,在每個注液孔中分別加入60μl培養(yǎng)基,注意,槍頭要懸在孔上方滴入培養(yǎng)基(圖二)
3.將通道載玻片再放入二氧化碳培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)2-4小時左右,等到細胞剛剛長滿為單細胞層,即可開始實驗(圖三)。注意,要使用單層細胞進行剪切力實驗,使每個細胞均受到均勻的剪切力。
圖三
3.靜置條件下細胞培養(yǎng)。在通道載玻片中靜置培養(yǎng)的細胞可以作為流體剪切力條件下培養(yǎng)的細胞對照。待流體實驗開始的同時,將靜置細胞培養(yǎng)的對照組放入二氧化碳培養(yǎng)箱中進行7天的培養(yǎng)。注意,培養(yǎng)過程中每天都要更換培養(yǎng)基。
二)搭建流體系統(tǒng)
2.連接通道載玻片。去除氣泡后,就可以將之前準備好的含貼壁細胞的通道載玻片與灌流管相連。將搭載灌流管的流體單元從流體剪切力系統(tǒng)中取下,放到超凈臺中。將通道載玻片的注液孔用培養(yǎng)基裝至過滿狀態(tài)(?)。之后就按照下面的流程圖連接通道載玻片(圖四)。
圖四:a)封口夾輕輕將灌流管的硅膠管夾住。b)將其中一個魯爾接頭從中間的鏈接管中拔出。c-j)按圖示,將魯爾接頭與通道載玻片的注液孔相連,注意不能產(chǎn)生氣泡,會有部分培養(yǎng)基溢出。k)連接好后,將封口夾移除,用無塵紙將溢出的培養(yǎng)基擦除。l)全部連接好后,用顯微鏡觀測一下通道內(nèi)的細胞狀態(tài)。
3)檢查灌流系統(tǒng)是否密封、是否將灌流管插入了正確的閥門。將封口夾夾住其中一根硅膠管,如果兩邊的灌流儲液管液面不會下降或者上升,那么,整個系統(tǒng)就是密封的,并且是正確安裝的(圖五)。
圖五。
4.開始流體剪切力實驗(單向?qū)恿鳎⒋罱ê玫牧黧w單元與流體剪切力泵相連后,將整個流體單元放入二氧化碳培養(yǎng)箱中。打開控制軟件,設(shè)置實驗條件與步驟。為了使貼壁細胞適應(yīng)剪切力培養(yǎng)環(huán)境。先用低剪切力刺激,逐步提高并且保持在一定的剪切力(表二)。
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三 )實驗結(jié)果
一.形態(tài)對比
在培養(yǎng)7天之后,可以直接用顯微鏡觀察到細胞的形態(tài)發(fā)生了顯著的變化,在剪切力刺激下培養(yǎng)的細胞形態(tài)更加修長,排列更加緊密和規(guī)律。而靜置狀態(tài)下培養(yǎng)了7天的細胞形態(tài)沒有顯著的變化(圖六)。
圖六:如上所示,在20 dyn/cm2刺激下的細胞更為修長排列更加緊密。
圖七:HUVEC細胞在20 dyn/cm2刺激7天的免疫熒光結(jié)果??梢钥吹郊毎羌芘帕蟹较蚍浅R恢隆K{色:細胞核;綠色:VE- cadherins;紅色:actin filaments
圖八:靜置狀態(tài)下培養(yǎng)7天的HUVEC細胞,可以看見細胞骨架排雷沒有規(guī)律性,并且表達量也略少。
三.實驗總結(jié)
綜上所述,對于HUVEC細胞而言,流動剪切力的培養(yǎng)環(huán)境更為貼近其自然生長的環(huán)境,我們實驗說明在靜置狀態(tài)下并不能展現(xiàn)出HUVEC細胞的生理特性。